Версия для печати Adobe PDF
— Иммунология, 2003, №1, c.9-11.


Усиление образования антител под влиянием иммуномодулятора Гепон


Атауллаханов Р.И.,Катлинский А.В.,Холмс Р.Д.,Мастернак Т.Б.,Ларин А.С.,Малкина Е.Ю.,Шишкова Н.М.
ООО Иммафарма, Московская медицинская академия им. Сеченова, Immutic Group, ГНЦ-Институт иммунологии МЗ РФ.



Резюме

В работе исследовано влияние иммуномодулятора Гепон на процесс антителогенеза у лабораторных мышей. Установлено, что введение Гепона мышам способствует повышению интенсивности иммунных реакций, индуцированных корпускулярным (эритроциты барана) и растворимым (яичный альбумин) гетерологичными "Т-зависимыми" антигенами. Гепон усиливал антителообразование при инъекционном применении (дозы 0,01-1 мкг) в смеси с антигеном, при предварительной инъекции (дозы 0,01-10 мкг) за 60 минут до введения антигена и при продолжительном курсовом оральном (доза 0,5 мг) применении перед иммунизацией антигеном. Под влиянием Гепона в селезенке мышей продуцировалось в 2,5 раза больше клеток, секретирующих IgM-антитела, а в периферической крови накапливалось в 2 раза больше агглютининов и в 3 раза больше гемолизинов, специфичных к использованному антигену. Двукратная иммунизация смесью Гепона с водорастворимым белковым антигеном приводила к накоплению в крови мышей в 2-7 раз большей концентрации специфических к антигену IgG-антител в ходе вторичной иммунной реакции.


Препарат Гепон (рег. Р№000015/04-2001) является синтетическим тетрадекапептидом [1], разрешен для применения в качестве иммуно-модулятора для коррекции ослабленного иммунитета, лечения и профилактики оппортунистических инфекций (инструкция Фармакологического комитета МЗ РФ от 12.04.2001).

Настоящая статья начинает серию сообщений о механизмах иммуномодули-рующего действия Гепона. В данной работе описано иммуноадъювантное действие Гепона в экспериментальных моделях синтеза антител.

Материалы и методы

В экспериментах использовали 1,5-2-месячных мышей (CBAxC57Bl)F1, полученных из питомника РАМН "Столбовая". Мыши содержались в стандартных условиях, получая корм и питьевую воду ad libitum. После прохождения карантина животных взвешивали и распределяли по группам (не менее 10 мышей в группе) так, чтобы в каждой из них средняя масса тела была 20±1 г.

В качестве гетерологичного корпускулярного антигена для иммунизации мышей применяли эритроциты барана (ЭБ). Субоптимальную иммуногенную дозу 5х106 ЭБ вводили внутрибрюшинно в 0,5 мл физиологического раствора NaCl. Интенсивность иммунного ответа на инъекцию ЭБ определяли через 4 дня после иммунизации по накоплению в селезенке антителообразующих клеток (АОК), секретирующих IgM-антитела, специфические к ЭБ. Количество АОК в селезенке определяли методом локального гемолиза в геле агарозы [2].

В качестве растворимого гетерологичного антигена применяли яичный альбумин (ЯА) производства Calbiochem (кат. 32467) или ICN Biochemicals (кат. 191224). Мышей иммунизировали внутрибрюшинно 50 мкг ЯА в 0,2 мл физиологического раствора NaCl. Повторную иммунизацию 50 мкг ЯА проводили спустя 4 недели. Через 1, 2, 3 и 4 недели после повторной иммунизации мышей декапитировали, сыворотку крови собирали, пулировали в пределах экспериментальной группы, замораживали и хранили при минус 20°C до последующего исследования методом иммуноферментного анализа (ИФА). Интенсивность иммунного ответа определяли по уровню сывороточных IgG-антител, специфически связывающихся с ЯА.

Содержание антител, специфичных к ЯА в сыворотке крови мышей определяли методом твердофазного ИФА. ЯА в карбонатно-бикарбонатном буфере в концентрации 10мкг/мл вносили в лунки 96-луночного планшета MaxiSorb (Nunc, кат. 442404), инкубировали в течение ночи при 4-8°C. После отмывания избытка ЯА, не связавшегося с твердой фазой, в лунки панели вносили раствор, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,1% твина-20, инкубировали 30 минут при 37°C. После инкубации лунки промывали, вносили разведения тестируемой сыворотки в растворе, содержащем БСА и твин-20, инкубировали 60 минут при 37°C. Связавшиеся с ЯА IgG-антитела мыши выявляли с помощью пероксидазного конъюгата овечьих антител, специфичных к F(ab)2 фрагменту мышиного IgG (Sigma кат.A7282). В качестве субстрата в лунки вносили орто-фенилендиамин (3 мг/мл), реакцию останавливали 4н H2SO4, интенсивность реакции измеряли на фотометре Dynex MRX при l 490 нм.

Гепон производства ООО Иммафарма растворяли в физиологическом растворе NaCl, вводили мышам внутрибрюшинно в диапазоне доз от 10 нг до 10 мкг за 60 минут до введения ЭБ или одновременно с ЯА. Иммуноадювантное действие Гепона сравнивали с известными иммуноадъювантами - полиоксидонием (ООО Иммафарма) и полным адъювантом Фройнда (ПАФ, Calbiochem кат. 344289). Для этого отдельные группы мышей получали инъекцию полиоксидония перед иммунизацией ЭБ или инъекцию эмульсии ЯА в 0,1 мл ПАФ.

Одним из способов применения Гепона, рекомендованных инструкцией по его медицинскому применению, является оральный прием препарата в виде продолжительного курса лечения в течение 20 дней и более. В экспериментах на мышах мы смоделировали курсовой прием Гепона per os и исследовали влияние продолжительной терапии Гепоном на способность мышей к антительной реакции на гетерологичные эритроциты. Эксперименты проводили на 2 больших группах мышей из одного помета, по 27 мышей в каждой группе. В одной группе животные ежедневно в течение 20 дней получали Гепон в разовой дозе 0,5 мг на мышь (25 мг/кг) per os в 0,2 мл дистиллированной воды. В другой (контрольной) группе животные получали ежедневно в течение 20 дней по 0,2 мл дистиллированной воды per os. После проведенного 20-дневного курса мышей обеих групп иммунизировали внутрибрюшинно 2х107 ЭБ, двукратно с интервалом 3 недели между иммунизациями. Перед иммунизацией и еженедельно после иммунизации у животных из ретроорбитального синуса брали кровь (не более 100 мкл от каждой мыши), объединяли образцы крови внутри группы и выделяли сыворотку. Пулированные образцы сыворотки замораживали и сохраняли до последующего исследования при температуре минус 20°C. Содержание антител к ЭБ в сыворотках крови оценивали в реакциях гемагглютинации и гемолиза [3].

Результаты и обсуждение

Первичная продукция IgM-антител к корпускулярному антигену.

Через 4 дня после внутрибрюшинной инъекции 5х106 ЭБ в селезенках мышей накапливалось в среднем 600±75 АОК, секретирующих IgM-антитела, специфические к антигенам ЭБ. Фоновый уровень таких АОК не превышал 50 на селезенку. Инъекционное введение Гепона за 60 минут до иммунизации ЭБ усиливало иммунную реакцию на антиген, число АОК в селезенке возрастало до 1500±200 (рис.1).

Рис. 1. Зависимость иммуноадъювантного действия от дозы Гепона в модели первичной продукции IgM-антител в ответ на гетерологичные эритроциты. Представлены нормированные значения числа АОК в группах мышей, иммунизированных 5 млн. ЭБ через 60 мин после инъекции Гепона. Ось ординат - коэффициент стимуляции продукции АОК, соответствует числу АОК в расчете на селезенку, нормированному на значение числа АОК в контрольной группе, иммунизированной 5 млн. ЭБ. Дозы Гепона указаны по оси абсцисс.

Оптимальное иммуноадъювантное действие наблюдалось при внутрибрюшинном введении 0,1-1 мкг Гепона. Дозы 0,01 мкг и 10 мкг Гепона оказывали меньшее, хотя и вполне значительное, иммуноадъювантное влияние. Следовательно, Гепон в диапазоне доз от 0,01 до 10 мкг (в расчете на мышь) усиливал продукцию антител, специфичных к антигенам гетерологичных эритроцитов. Широкий "терапевтический" интервал свидетельствует об отсутствии токсического влияния возрастающих доз Гепона, то есть о безопасности препарата.

Иммуноадъювантный эффект Гепона в модели первичного иммунного ответа на ЭБ был сравним с иммуноаодъвантным эффектом полиоксидония. Внутрибрюшинное введение полиоксидония (дозы 0,5-1 мг/мышь) перед иммунизацией 5х106 ЭБ приводило к 2-4-кратному увеличению числа АОК, накапливающихся в селезенке через 4 дня после иммунизации.

Вторичная продукция гемолизинов (ГЛ) и гемагглютининов (ГА).

В таблице 1 представлены результаты, полученные в экспериментах по курсовому оральному введению Гепона. После 20-дневного приема Гепона (доза 0,5 мг/мышь per os) иммунная реакция на чужеродный антиген была более интенсивной, чем у контрольных мышей, не получавших Гепона. Иммуномодулирующий эффект орального приема Гепона особенно четко проявлялся в отношении вторичной иммунной реакции на ЭБ. В группе мышей, получавших Гепон в течение 20 дней, титры сывороточных гемагглютининов после вторичной иммунизации ЭБ оказались в 2 раза, а титры гемолизинов - в 3 раза выше, чем у контрольных животных, не получавших Гепона.

Таб. 1. Влияние 20-дневного орального введения Гепона на продукцию антител у мышей (СВАхС57Вl)F1 в ответ на двукратную иммунизацию 20 млн. ЭБ.

Рис. 2. Кривые титрования в ИФА сывороток мышей, иммунизированных ЯА в смеси с Гепоном или без него. 1- контрольные мыши, дважды получили инъекцию физиологического раствора; 2- двукратная иммунизация 50 мкг ЯА в физиологическом растворе; 3 - двукратная иммунизация смесью 50 мкг ЯА с 0,01 мкг Гепона; 4 - двукратная иммунизация смесью 50 мкг ЯА с 0,1 мкг Гепона; 5 - двукратная иммунизация смесью 50 мкг ЯА с 1 мкг Гепона; 6 - двукратная иммунизация смесью 50 мкг ЯА с 10 мкг Гепона.

Вторичная продукция IgG-антител к водорастворимому белковому антигену.

Через 1-2 недели после повторной внутрибрюшинной иммунизации белковым антигеном ЯА (50 мкг) в крови контрольных мышей накапливалось небольшое количество IgG-антител, специфически связывающихся с ЯА. ИФА-титр антител в сыворотке крови не превышал 1:300, максимальная интенсивность ИФА-реакции достигала значений OD = 0,35.

Введение Гепона (дозы 0,01-1 мкг/мышь) совместно с 50 мкг ЯА приводило к развитию иммунной реакции, более интенсивной, чем при введении 50 мкг ЯА без Гепона (рис.2 и 3). Максимальный адъювантный эффект наблюдался при введении 0,01 мкг Гепона совместно с антигеном. В сыворотке крови мышей, иммунизированных 50 мкг ЯА в смеси с 0,01 мкг Гепона, накапливалось в 7,6 раза больше ЯА-специфических антител, чем в сыворотке крови мышей, иммунизированных 50 мкг ЯА без Гепона. В случае применения 0,01 мкг Гепона вместе с ЯА ИФА-титры антител достигали 1:2300, максимальная интенсивность ИФА-реакции OD = 0,71.

Рис. 3. Зависимость иммуноадъювантного действия от дозы Гепона в модели вторичной продукции IgG-антител в ответ ЯА. Интенсивность продукции антител представлена в виде: (а) максимальной оптической плотности в ИФА при детекции антител к ЯА в сыворотке крови мышей; (б) ИФА-титра антител к ЯА в сыворотке крови мышей. Титром считали разведение сыворотки в ИФА, дающее OD = 0,2, что соответствовало 2х cut off.

Следует отметить, что вполне значимый иммуноадъювантный эффект Гепона в модели иммунизации мышей ЯА был существенно слабее, чем эффект ПАФ. Инъекция мышам эмульсии 50 мкг ЯА в 0,1 мл ПАФ приводила к интенсивной продукции антител к ЯА (ИФА титр выше 1:100000, OD>1,5).

Выводы

  1. Введение Гепона лабораторным мышам способствует повышению интенсивности иммунных реакций, индуцированных корпускулярным (ЭБ) и растворимым (ЯА) гетерологичными "Т-зависимыми" антигенами.
  2. Гепон усиливает антителообразование при инъекционном применении (дозы 0,01-1 мкг) в смеси с антигеном, при предварительной инъекции (дозы 0,01-10 мкг) за 60 минут до введения антигена, и при продолжительном курсовом оральном (доза 0,5 мг) применении перед иммунизацией антигеном.
  3. Инъекционное введение Гепона при первичной иммунизации корпускулярным антигеном приводило к накоплению в селезенке мышей в среднем в 2,5 раза большего числа АОК, секретирующих IgM-антитела, специфичные к использованному антигену.
  4. Ежедневный прием Гепона per os в течение 20 дней до проведения двукратной иммунизации приводил к накоплению в сыворотке крови мышей в 2 раза большей концентрации агглютининов и в 3 раза большей концентрации гемолизинов, специфических к использованному антигену (ЭБ).
  5. Инъекционное введение Гепона в смеси с водорастворимым белковым антигеном приводило к накоплению в крови мышей в 2-7 раз большей концентрации специфических к антигену IgG-антител в ходе вторичной иммунной реакции.

Литература

  1. US Patent 5773573 dated 30.06.1998.
  2. Jerne N.K., Nordin A.A. Science,1963, v.140, p.405.
  3. Зигль Э. В кн.: Иммунологические методы. М., Мир,1979, с.108.


Версия для печати Adobe PDF
— Иммунология, 2003, №1, c.9-11.