Версия для печати Adobe PDF
— Иммунология, 2003, №1, с.12-14.


Иммуноадъювантное действие структурных гомологов иммуномодулятора Гепон


Катлинский А.В.,Атауллаханов Р.И., Холмс Р.Д., Пичугин А.В., Мастернак Т.Б., Малкина Е.Ю., Шишкова Н.М.
ООО Иммафарма, Московская медицинская академия им. Сеченова, Immutic Group, ГНЦ-Институт иммунологии МЗ РФ.



Резюме

Изучена связь между структурой и иммуномодулирующими свойствами препарата Гепон, представляющего собой синтетический тетрадекапептид (HP1-14). Описано иммуноадъювантное действие структурных фрагментов Гепона у лабораторных мышей в моделях первичного синтеза IgM-антител к антигенам гетерологичных эритроцитов и вторичного синтеза IgG-антител к растворимому гетеролочному белковому антигену. Установлено, что синтетические фрагменты, копирующие N-конец (HP1-5, HP1-9, HP1-11), С-конец (HP10-14, HP6-14, HP4-14), а также центральную часть (HP4-11 и HP3-12) молекулы Гепона, обладают иммуноадъювантным действием. Укорочение тетрадекапептида Гепона на 2 аминокислотных остатка с N-конца и 2 аминокислотных остатка с С-конца не нарушает иммуноадъювантной активности пептида. Укорочение тетрадекапептида Гепона на 3 аминокислотных остатка с каждого из концов полипептидной цепи приводит к существенному ослаблению его иммуноадъювантных свойств. Пентапептиды, копирующие N- и С-концы полипептидной цепи Гепона, обладают иммуноадъювантной активностью, сравнимой с Гепоном.




Препарат Гепон (рег. Р№000015/04-2001) является синтетическим тетрадекапептидом [2], разрешен для применения в качестве иммуно-модулятора для коррекции ослабленного иммунитета, лечения и профилактики оппортунистических инфекций (инструкция Фармакологического комитета МЗ РФ от 12.04.2001).

В предшествующем сообщении [1] было показано, что введение Гепона в организм экспериментальных животных приводит к усилению продукции IgM-антител в ходе первичной реакции на корпускулярный антиген и IgG-антител в ходе вторичной реакции на растворимый белковый антиген. В данной работе исследована зависимость иммуномодулирующих свойств Гепона от особенностей его структуры, в частности, описано иммуноадъювантное действие структурных фрагментов Гепона в экспериментальных моделях синтеза антител.

Материалы и методы

В экспериментах использовали 1,5-2-месячных мышей (CBAxC57Bl)F1, полученных из питомника РАМН "Столбовая". Мыши содержались в стандартных условиях вивария. После прохождения карантина животных взвешивали и распределяли по группам (не менее 10 мышей в группе) так, чтобы в каждой из них средняя масса тела была 20 ±1 г.

В качестве гетерологичного корпускулярного антигена для иммунизации мышей применяли эритроциты барана (ЭБ). Субоптимальную иммуногенную дозу 5х106 ЭБ вводили внутрибрюшинно в 0,5 мл физиологического раствора NaCl. Интенсивность иммунного ответа на инъекцию ЭБ определяли через 4 дня после иммунизации по накоплению в селезенке антителообразующих клеток (АОК), секретирующих IgM-антитела, специфические к ЭБ. Количество АОК в селезенке определяли методом локального гемолиза в геле агарозы [3].

В качестве гетерологичного растворимого антигена применяли яичный альбумин (ЯА) производства Calbiochem (кат. 32467) или ICN Biochemicals (кат. 191224). Мышей иммунизировали внутрибрюшинно 50 мкг ЯА в 0,2 мл физиологического раствора NaCl. Повторную иммунизацию 50 мкг ЯА проводили спустя 4 недели. Через 1, 2, 3 и 4 недели после повторной иммунизации мышей декапитировали, сыворотку крови собирали, пулировали в пределах экспериментальной группы, замораживали и хранили при минус 20°C до последующего исследования. Интенсивность иммунного ответа определяли по уровню сывороточных IgG-антител, специфически связывающихся с ЯА.

Содержание антител, специфичных к ЯА, в сыворотке крови мышей определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). ЯА в карбонатно-бикарбонатном буфере в концентрации 10 мкг/мл вносили в лунки 96-луночного планшета MaxiSorb (Nunc, кат. 442404), инкубировали в течение ночи при 4-8°C. После отмывания избытка ЯА, не связавшегося с твердой фазой, в лунки панели вносили раствор, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,1% твина-20, инкубировали 30 минут при 37°С. После инкубации лунки промывали, вносили разведения тестируемой сыворотки в растворе, содержащем БСА и твин-20, инкубировали 60 минут при 37°C. Связавшиеся с ЯА IgG-антитела мыши выявляли с помощью пероксидазного конъюгата овечьих антител, специфичных к F(ab)2 фрагменту мышиного IgG (Sigma кат.A7282). В качестве субстрата в лунки вносили орто-фенилендиамин (3 мг/мл), реакцию останавливали 4н H2SO4, интенсивность реакции измеряли на фотометре Dynex MRX при ? 490 нм.

Гепон тетрадекапептид TEKKRRETVEREKE и его структурные фрагменты, соответствующие а.к.1-5 с N-конца (HP1-5), а.к.1-9 (HP1-9), а.к. 1-11 (HP1-11), а.к.10-14 (HP10-14), а.к. 6-14 (HP6-14), а.к.4-14 (HP4-14), а.к. 4-11 (HP4-11) и а.к. 3-12 (HP3-12), синтезированы ООО Иммафарма. Пептиды растворяли в физиологическом растворе NaCl, вводили мышам внутрибрюшинно в диапазоне доз от 10 нг до 10 мкг за 60 минут до введения ЭБ или одновременно с ЯА.

Результаты и обсуждение

Иммуноадъвантные свойства Гепона (а.к.1-14)

Введение Гепона мышам за 60 мин до их иммунизации ЭБ приводило к усиленной иммунной реакции на антигены ЭБ. Так, через 4 дня после внутрибрюшинной иммунизации 5х106 ЭБ в селезенках мышей накапливалось в среднем 600±75 АОК, секретирующих IgM-антитела, специфические к антигенам ЭБ. Инъекция Гепона за 60 минут до иммунизации усиливала иммунную реакцию на антиген, число АОК в селезенке возрастало в 2-3 раза (таблица 1, рис. 1). Оптимальное иммуноадъювантное действие наблюдалось при внутрибрюшинном введении 0,1-1 мкг Гепона.

Таблица 1

Рисунок 1. Зависимость иммуноадъювантного действия от дозы Гепона и его фрагментов в модели первичной продукции IgM-антител в ответ на иммунизацию мышей эритроцитами барана.
По оси абсцисс - доза пептида (мкг/мышь), введенная мышам внутрибрюшинно за 60 минут до иммунизации 5х106 ЭБ. По оси ординат - число АОК, секретирующих IgM-антитела к ЭБ, обнаруженное в селезенке мышей через 4 дня после иммунизации. Представлены значения числа АОК, нормированные на число АОК у контрольных мышей, иммунизированных ЭБ без пептидов.

Введение Гепона совместно с белковым антигеном ЯА приводило к развитию иммунной реакции, в 2-7 раз более интенсивной, чем при введении ЯА без Гепона (рис.2, таблица 2). Через 1-2 недели после повторной внутрибрюшинной иммунизации 50 мкг ЯА в крови контрольных мышей накапливалось небольшое количество IgG-антител, специфически связывающихся с ЯА. ИФА-титр антител в сыворотке крови составлял 1:260, максимальная интенсивность ИФА-реакции достигала значений OD = 0,396. Введение Гепона (дозы 0,01-1 мкг/мышь) совместно с 50 мкг ЯА приводило к развитию иммунной реакции, более интенсивной, чем при введении 50 мкг ЯА без Гепона. Максимальный адъювантный эффект наблюдался при введении 0,01 мкг Гепона совместно с антигеном. В сыворотке крови мышей, иммунизированных 50 мкг ЯА в смеси с 0,01 мкг Гепона, накапливалось в 5 раз больше ЯА-специфических антител (ИФА-титр 1:1300, максимальная интенсивность ИФА-реакции OD = 0,691), чем в сыворотке крови мышей, иммунизированных 50 мкг ЯА без Гепона.

Иммуноадъювантные свойства центральной части молекулы Гепона

Центральная часть молекулы Гепона была представлена двумя пептидами. Пептид HP3-12 соответствовал структуре Гепона, укороченной на 2 аминокислотных остатка с N-конца и 2 аминокислотных остатка с С-конца. Пептид HP4-11 соответствовал структуре Гепона, укороченной на 3 аминокислотных остатка с N-конца и 3 аминокислотных остатка с С-конца. Введение HP3-12 за 60 мин до иммунизации ЭБ приводило к усилению продукции АОК в 2,76 раза, а введение HP4-11 - в 1,67 раза (таблица 1, рисунок 1). То есть укорочение молекулы Гепона на 2 аминокислотных остатка с обоих концов полипептидной цепи не нарушает его иммуноадъювантных свойств, но удаление с каждого конца структуры Гепона 3 аминокислотных остатков приводит к заметному ослаблению его иммуноадъювантной активности. Следовательно, 3 или более остатков аминокислот с N- и С-концов молекулы Гепона имеют важное функциональное значение. Поэтому было интересно исследовать N - и С -концовые пептиды различной длины.

Таблица 2

Рисунок 2. Зависимость иммуноадъювантного действия от дозы Гепона и его фрагментов в модели вторичной продукции IgG-антител в ответ на иммунизацию мышей яичным альбумином (ЯА).
По оси абсцисс - доза пептида (мкг/мышь), введенная внутрибрюшинно в смеси с 50 мкг ЯА. По оси ординат - содержание IgG-антител к ЯА в сыворотке крови мышей через 7 дней после повторной иммунизации 50 мкг ЯА в смеси с пептидом или без него. Представлены значения ИФА-титров, нормированные на значения ИФА-титра антител к ЯА в крови контрольных мышей, дважды иммунизированных только ЯА без пептидов.

Иммуноадъювантные свойства N-концевых пептидов Гепона

В модели иммунной реакции на антигены ЭБ пептиды HP1-5, HP1-9 и HP1-11, имитирующие N-конец Гепона, усиливали первичную продукцию IgM-секретирующих АОК в 2,01, 1,77 и 1,63 раза, соответственно. В модели вторичной иммунной реакции на ЯА титры IgG-антител под влиянием HP1-5, HP1-9 и HP1-11 повышались в 5,7, 1,8 и 1,6 раза, соответственно. То есть короткая (5 аминокислотных остатков) копия N-конца Гепона оказалась вполне сравнимой по иммуноадъювантной активности с целой молекулой Гепона. Более длинные (9 и 11 аминокислотных остатков) копии N-конца Гепона тоже обладали иммуноадъювантной активностью, хотя и уступали Гепону.

Иммуноадъювантная активность С-концевых пептидов Гепона

В модели первичной иммунной реакции на антигены ЭБ гомологи С-конца Гепона HP10-14, HP6-14 и HP4-14 усиливали продукцию IgM-секретирующих АОК в 3,25, 2,6 и 2,65 раза, соответственно. При иммунизации мышей ЯА в смеси с HP10-14, HP6-14 или HP4-14 индуцировалась антительная реакция, более интенсивная, чем при иммунизации ЯА без пептидов. Под влиянием HP10-14, HP6-14 и HP4-14 титры IgG-антител к ЯА в сыворотке крови иммунизированных мышей возрастали в 10, 1,8 и 2 раза, соответственно. Следовательно, пептидные копии С-концевой структуры Гепона обладают иммуноадювантной активностью. Как и в случае с N-концевыми пептидами, короткий (5 аминокислотных остатков) гомолог С-концевой части Гепона HP10-14 оказался наиболее активным из исследованных С-концевых пептидов. Иммуноадъювантная активность HP10-14 была сравнима с активностью Гепона и заметно превышала активность более длинных C-концевых фрагментов Гепона HP6-14 и HP4-14.

В целом, полученные данные свидетельствуют об особом значении N-и С-концевых аминокислотных остатков для иммуномодулирующей активности Гепона. Укорочение тетрадекапептидной структуры Гепона более, чем на 2 аминокислотных остатка с N- и С-концов приводит к существенному ослаблению его иммуноадъювантных свойств. Принципиальное значение концевых фрагментов для иммуномодулирующей активности Гепона подтверждается также тем фактом, что короткие (5 аминокислотных остатков) копии N- и С-концевых участков Гепона обладают сравнимой с Гепоном иммуноадъвантной активностью в тестах синтеза IgM- и IgG-антител в процессе первичной и вторичной иммунных реакций.

Выводы

  1. Синтетические фрагменты HP1-5, HP1-9, HP1-11, HP10-14, HP6-14, HP4-14, HP4-11 и HP3-12, копирующие N- и С-концевые участки, а также центральную часть молекулы Гепона, обладают иммуноадъювантным действием.
  2. Укорочение тетрадекапептида Гепона на 2 аминокислотных остатка с N-конца и 2 аминокислотных остатка с С-конца не нарушает иммуноадъювантной активности пептида. Укорочение тетрадекапептида Гепона на 3 аминокислотных остатка с каждого из концов полипептидной цепи приводит к существенному ослаблению его иммуноадъювантных свойств.
  3. Пентапептиды, копирующие N- и С-концы полипептидной цепи Гепона, обладают иммуноадъювантной активностью, сравнимой с Гепоном.

Литература

  1. Р.И.Атауллаханов, А.В.Катлинский, Р.Д.Холмс и соавт. Усиление образования антител под влиянием иммуномодулятора Гепон - Иммунология, 2002.
  2. Holms R. US Patent 5773573 dated 30.06.1998.
  3. Jerne N.K., Nordin A.A. Science, 1963, v.140, p.405.


Версия для печати Adobe PDF
— Иммунология, 2003, №1, с.12-14.