Версия для печати Adobe PDF
— Вопросы вирусологии, 2003, №4, c.40-44.


Изучение противовирусной активности иммуномодулятора "Гепон"
в экспериментах на модели уличного вируса бешенства


Грибенча С.В., Холмс Р.Д., Атауллаханов Р.И., Баринский И.Ф.
ГУНИИ вирусологии им Д.И.Ивановского РАМН , ГНЦ Институт иммунологии МЗ РФ, ООО "Иммафарма", Москва; Immutic Group, Лондон, Великобритания.




Стратегия предупреждения развития бешенства у инфицированных людей обоснованно базируется на комбинированном применении антирабической вакцины и иммуноглобулина (Доклады Комитета экспертов по бешенству ВОЗ, 1974, 1992, 1996). Основная функция антирабического иммуноглобулина (АИГ), гомологичного или гетерологичного, состоит в создании пассивного иммунитета с целью предупреждения развития бешенства с коротким инкубационным периодом [25,26]. Однако АИГ, в особенности гетерологичный, реактогенен (вызывает аллергические реакции, в том числе анафилактический шок и сывороточную болезнь), интерферирует с вакциной [20,21] и блокирует индукцию иммунных Т-киллеров [5]. Последнее может быть причиной неудач антирабического лечения. Кроме того в конце II - начале III тысячелетия возникли две новые проблемы в профилактике бешенства: проблема профилактики бешенства у пациентов с супрессией различных компонентов иммунного ответа [17] и проблема предупреждения развития бешенства у ВИЧ-инфицированных лиц [23].

Изложенное выше, а также сообщения о случаях заболевания людей бешенством, несмотря на своевременное и правильное проведение полного курса прививок [14,16,24], указывает на необходимость не только совершенствования принятого метода лечения, но и поиска альтернативных специфических и неспецифических препаратов для профилактики этой, пока абсолютно летальной для человека инфекции.

Целью нашего исследования было изучение противовирусной активности нового иммуномодулятора "Гепон" при экпериментальном бешенстве. Ранее сообщалось об успешном применении Гепона в лечении инфекционно-воспалительных заболеваний, в частности, респираторных вирусных инфекций [10,11] и герпес-вирусной инфекции [3,4]. К тому же имеются данные о противовирусном действии Гепона в культурах клеток человека, инфицированных вирусом энцефаломиокардита [9] и вирусом гепатита С [1].

Материалы и методы

Животные

Работу проводили на беспородных белых мышах, самках, массой 14 -16 г. Мышей взвешивали и распределяли в группы по 20 животных в каждой.

Вирус

Использовали уличный вирус бешенства, штамм "Як" [18], 3-й пассаж. Вирус вводили лабораторным мышам внутримышечно по 0,1 мл вирус-содержащей взвеси ткани головного мозга мыши в разведении от 1:700 до 1:1000. Доза вируса при заражении мышей варьировала от 7 до 10 ЛД50/0,1 мл. После заражения за животными наблюдали в течение 30 дн., фиксируя сроки появления клинических симптомов бешенства и день гибели после заражения.

Диагноз бешенства подтверждали в отпечатках ткани головного мозга мышей методом прямой иммунофлуоресценции с использованием флуоресцирующих моноклональных антител, специфичных к нуклеопротеину - структурному белку вируса бешенства, штамм Внуково-32 [6].

Препараты

В работе использовали официнальный стерильный препарат "Гепон 0,002" производства ООО Иммафарма (Москва). Препарат представляет собой синтетический тетрадекапептид формулы TEKKRRETVEREKE.

В качестве положительного контроля противовирусного средства применяли "Ридостин" производства НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Растворы препаратов вводили мышам за 24 ч и 1 ч до заражения, а также через 1ч, 3ч, 24ч и/или 48ч после заражения. Препараты вводили внутрибрюшинно (в/б), внутримышечно (в/м) или в ткань головного мозга (интрацеребральное введение, и/ц).

Противовирусный эффект препаратов определяли по проценту защиты животных, который вычисляли по разнице между гибелью животных в опыте и в контроле. Статистическую обработку результатов исследования проводили по Фишеру [12]. Среднюю продолжительность инкубационного периода вычисляли по Мейнелу [13].

В данной работе, при изучении защитной активности исследуемых препаратов впервые был применен новый подход - "динамичный метод оценки противовирусной активности препаратов". Суть подхода заключается в определении статистическими методами уровня защиты животных (или клеток) в динамике, на протяжении всего периода наблюдения. Дополнительная информация о данном подходе представлена в разделе "Результаты исследования".

Результаты

Исследование токсичности препаратов. Токсичность препаратов определяли на мышах массой 9-12 г при интрацеребральном (и/ц) методе введения в дозах, которые затем исследовали по противовирусной активности. За животными наблюдали в течение 21 дня после введения препаратов.

Полученные результаты показали, что все мыши, которым в мозг вводили Гепон или ридостин, были совершенно здоровыми на протяжении всего срока наблюдения.

Изучение защитной активности препарата Гепон у мышей, зараженных уличным вирусом бешенства, штамм "Як". В первом эксперименте мышей распределили на 5 экспериментальных групп по 20 животных в каждой. Препараты вводили трижды: за 24 ч (в/б) и 1 ч (в/м) до заражения, и через 24 ч (в/б) после заражения. Препарат Гепон вводили в дозах 0,01 мкг, 0,1 мкг и 1 мкг. Ридостин вводили в дозе 45 мкг. Мышей заражали внутримышечно вирусом в дозе 7 ЛД50/0,1 мл. Результаты представлены в таблице 2. Смертность мышей в группе контрольного заражения составила 80%, средняя продолжительность инкубационного периода - 10,1 дня. В группе животных, получивших ридостин, смертность снизилась до 50% (защита 30%, p< 0,05), среднее значение инкубационного периода увеличилось до 11 дней.

Таблица 1. Изучение защитной активности Гепона в зависимости дозы у мышей, зараженных в мышцу уличным вирусом бешенства, штамм Як.

Таблица 1. Изучение защитной активности Гепона в зависимости дозы у мышей, зараженных в мышцу уличным вирусом бешенства, штамм "Як".

В группах животных, получивших инъекции Гепона, была очевидной тенденция к защите. Смертность мышей уменьшилась до 60-65% (защита 15-20%, p>0,05), Защита, зарегистрированная к концу срока наблюдения (30-й день) имела достоверность меньше 95%, поэтому может рассматриваться только как тендеция. Вместе с тем, среднее значение инкубационного периода увеличилось до 11,9 дней (группа, получившая три инъекции по 0,1 мкг Гепона, табл. 1), что свидетельствовало о реальном торможении рабической инфекции у животных, получивших Гепон.

Необходимо было найти объективные критерии, подтверждающие факт ингибирования рабической инфекции Гепоном. В ходе анализа динамики заболеваемости животных в опыте и контроле возникла идея определения статистическим методом уровня защиты животных в динамике срока наблюдения. В описанном выше эксперименте, начиная с 11-го дня после заражения мышей вирусом бешенства, когда заболеваемость в контроле превысила 50%, ежедневно (и до конца срока наблюдения), во всех опытных группах определяли уровень защиты и его достоверность по отношению к контролю вируса. Проведенные расчеты представлены в таблице 2.

Таблица 2.   Уровень защиты животных, зараженных в мышцу уличным вирусом бешенства, штамм

Таблица 2. Уровень защиты животных, зараженных в мышцу уличным вирусом бешенства, штамм "Як",в зависимости от дозы гепона и времени (дни) после заражения.

Таблица 3.   Влияние дозы и схемы введения гепона на динамику уровня защиты животных, зараженных в мышцу уличным вирусом Бешенства, штамм Як.

Таблица 3. Влияние дозы и схемы введения гепона на динамику уровня защиты животных, зараженных в мышцу уличным вирусом Бешенства, штамм "Як".

Из таблицы 3 видно, что в группе мышей, получивших 0,1 мкг Гепона, с 11-го по 15-й день имела место защита 30-35%, с достоверностью, превышающей 95%, а с 16-го по 17-й день - защита 40%, с достоверностью более 99%. Далее на 18-й день заболели 3 мыши, на 24-й день - 1 мышь и на 30-й день - еще 1 мышь. Следовательно, из 13 заболевших в этой группе мышей, 38,5% животных заболели после значительно более продолжительного инкубационного периода (среднее значение 20,8 дня), чем животные в контроле (среднее значение инкубационного периода 10,1 дня).

Полученные результаты позволили предположить, что заболеваемость части животных с более длинным инкубационным периодом могла быть связана с короткой схемой применения Гепона. Поэтому в следующем эксперименте препарат вводили четырехкратно: за 24 ч (в/б) и 1 ч (в/м) до заражения, и через 24 ч (в/б) и 48 ч (в/б) после заражения, а условия опыта сделали более жесткими, увеличив заражающую дозу вируса до 10 ЛД50. Кроме того, в схему второго эксперимента ввели группу более молодых мышей с меньшей массой тела (12,6 г - 13,35 г), менее устойчивых к рабической инфекции по сравнению с мышами других групп (14 г - 16 г). Мышам с меньшим весом тела вводили Гепон в дозе 0,1 мкг пять раз: за 24 ч (в/б) до заражения, а также через 2 ч (в/м), 4 ч (и/ц), 24 ч (в/м) и 48 ч (в/б) после заражения.

Результаты эксперимента, представленные в таблице 3, подтвердили наши предположения о значении продолжительности курса лечения Гепоном. Из таблицы 3 видно, что препарат в дозе 0,1 мкг/мышь, независимо от схемы применения и массы животных, оказывал защитное действие. Оно достоверно проявлялось с 13-го дня после заражения и до конца срока наблюдения (30-й день), когда защита составляла 30-40% с достоверностью, превышающей 95-99%. В эти же сроки гибель мышей в контрольной группе составила 95%. Достоверное (p<0,05) защитное действие с 13-го по 17-й день наблюдалось и в группе мышей, которым вводили Гепон в дозе 1 мкг/мышь. Доза 0,01 мкг, как и в первом эксперименте, оказалась неэффективной. Ридостин защищал 45-50% животных, однако, разница между уровнем защиты ридостина и Гепона была недостоверной (p>0,05).

Защитная активность Гепона в зависимости от места его введения в условиях лечебной схемы применения (жесткий вариант испытания) у мышей, зараженных в мышцу уличным вирусом бешенства, штамм "Як". В описанных выше экспериментах комбинировали два способа введения Гепона. В каждой из 5 использованных схем препарат вводили внутрибрюшинно с обязательным однократным введением внутримышечно, в место введения вируса. Представлялось важным выяснить, что является решающим в механизме защиты животных - внутрибрюшинное (системное) применение препарата или внутримышечное, местное блокирование инфекции в воротах инфекции. Для выяснения этого вопроса в следующем эксперименте Гепон в дозе 0,1 мкг/мышь вводили троекратно только внутрибрюшинно или только внутримышечно. Введение препарата осуществляли через 1 ч, 24 ч и 48 ч после инфицирования животных вирусом в дозе 7LD50/0,1мл, то есть препарат использовали по лечебной схеме в жестком варианте испытания. В контрольной группе (положительный контроль защитной активности Гепона) Гепон вводили по 0,1 мкг 4 раза: за 24 ч (в/б) и 1 ч (в/м) до заражения и через 24 ч (в/б) и 48 ч (в/б) после заражения. Из результатов эксперимента, представленных в таблице 4, видно, что выраженная защита (40%, p<0,01) на протяжении всего срока наблюдения отмечалась только при внутримышечном методе введения Гепона. При внутрибрюшинном, то есть системном, применении препарата защита животных была недостоверной (17%, p>0,05). В группе положительного контроля защитной активности Гепона, в которой животным вводили препарат 4 раза - за 24 ч (в/б) и 1 ч (в/м) до заражения и через 24 ч (в/б) и 48 ч (в/б) после заражения, достоверная защита животных (30-35%, p<0,05) отмечалась с 12 по 21 день после заражения. В контроле заражения смертность животных составила 80%.

Таблица 4. Изучение защитной активности гепона в зависимости от способа его введения в условиях лечебной схемы применения.

Таблица 4. Изучение защитной активности гепона в зависимости от способа его введения в условиях лечебной схемы применения.

Обсуждение

Исследования, проведенные одним из нас ранее, показали, что наиболее чувствительным методом определения токсичности противовирусных препаратов является внутримозговой. Препараты могут выдерживать испытание на токсичность при внутривенном способе введения, но не проходят по токсичности при внутримозговом методе их применения [7]. Представленные в данной работе результаты испытаний по изучению токсичности при внутримозговом методе введения свидетельствуют о высокой степени безопасности Гепона и о возможности применения препарата путем введения в желудочки головного мозга.

Одним из важнейших требований к противовирусным препаратам в отношении бешенства является защитная активность и способность удлинять инкубационный период болезни [2,7]. Проведенные исследования по изучению противовирусной активности Гепона и впервые примененный новый подход по определению уровня защитной активности в динамике, в течение всего срока наблюдения, показали, что препарат обладает достаточно выраженной активностью при экспериментальной рабической инфекции.

Новый подход по определению защитной активности в динамике на протяжении срока наблюдения не только позволил выявить достоверную защитную активность Гепона, но и скорректировать схему его применения. При более продолжительной схеме применения Гепона достоверный уровень защиты (30-40%, p<0,05, p<0,01) pегистрировали на протяжении всего срока наблюдения (30 дней). Следовательно, новый подход позволил выработать оптимальную схему применения Гепона при рабической инфекции.

В первых двух экспериментах достоверная защитная активность Гепона была выявлена при комбинированной схеме применения препарата, до и после заражения животных. Кроме того, в этом варианте экспериментов 2-3 дозы препарата вводили внутрибрюшинно (системное введение), а одну дозу - внутримышечно в место введения вируса. В связи с этим возникли два очень важных для бешенства вопроса. Первый вопрос связан с возможностью обеспечения достоверной защиты при лечебной схеме применения Гепона, то есть после инфицирования животных. Как известно, лечебная профилактика бешенства начинается после инфицирования человека вирусом. Второй вопрос касается механизма противовирусного действия Гепона. Что является решающим фактором в обеспечении достоверной защиты - системное воздействие Гепона или местное действие на уровне "ворот инфекции"?

Результаты третьего эксперимента с очевидностью показали, что внутримышечное введение Гепона в месте введения вируса является решающим фактором в обеспечении достаточно выраженной и достоверной защиты (40%, p<0,01) на протяжении всего срока наблюдения. Этот важный факт, касающийся применения Гепона, полностью согласуется с полученными ранее экспериментальными [7,8,15,19] и клиническими [24,26,22] данными об абсолютной важности для профилактики бешенства введения противовирусных препаратов, в том числе, антирабических иммуноглобулинов в "ворота инфекции".

Другой важный результат исследований состоит в том, что Гепон оказывает достоверное защитное действие при лечебном варианте применения, то есть в режиме, принятом в практике здравоохранения.

Наконец, следует подчеркнуть, что в данном исследовании впервые применен новый подход, предложенный одним из авторов работы (С.В.Грибенча). Он состоит в определении уровня защиты в динамике, на протяжении всего периода наблюдения. В отличие от классического подхода "да" или "нет", ориентированного на сильнодействующие препараты, новый подход позволяет получать дополнительную, качественно новую информацию о противовирусных и иммуномодулирующих свойствах иммунных и химиопрепаратов мягкого действия. К препаратам "мягкого действия" авторы относят такие препараты, которые обеспечивают достаточный уровень противовирусной защиты, а также обладают широким спектром противовирусной активности и высоким уровнем безопасности. Новый подход позволяет "видеть" динамику роста и падения уровня защиты на протяжении срока наблюдения и соответственно корректировать и вырабатывать оптимальную схему применения исследуемых препаратов.

В заключение необходимо отметить, что выявленная противовирусная активность Гепона при рабической инфекции хорошо согласуется с данными о противовирусной активности Гепона при инфекции вирусами энцефаломиокардита [9], простого герпеса [3,4] и гепатита С [1]. Если принять во внимание, что наряду с противовирусной активностью Гепон обладает и иммуномодулирующими свойствами, то можно сделать вывод о перспективности его применения при бешенстве в комбинации с другими антирабическими препаратами в особенности у лиц c различными иммунодефицитами, а также у инфицированных ВИЧ, герпесом, гепатитами В и С.

В связи с изложенным, очень важно выяснить влияние препарата на формирование вакцинального антирабического иммунитета, что составит предмет дельнейшего исследования.

Литература

  1. Атауллаханов Р.И., Р.Д.Холмс, А.В.Катлинский, П.Г.Дерябин, А.Н.Наровлянский, М.В.Мезенцева, Ф.И.Ершов. Иммуномодулятор "Гепон" подавляет репликацию вируса гепатита С в культуре клеток человека in vitro // Антибиотики и химиотерапия. - 2002. - т. 47. - №8. - С. 9-11.
  2. Беер Д.М., Мур С.А., Шеддок Д.Г. Противовирусная активность ряда индукторов интерферона на модели вируса бешенства // Бюлл. ВОЗ.- 1979.- т. 57.- № 5.- С.535-541.
  3. Бибичева Т.В., Силина Л.В. Лечение рецидивирующего генитального герпеса иммуномодулятором Гепон. - В кн.: Тезисы докладов IX Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва.- 2002. - С. 56.
  4. >
  5. Бибичева Т.В., Силина Л.В. Иммуномодулятор Гепон для местной терапии герпес-вирусной инфекции. - В кн.: Тезисы докладов IX Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва.- 2002.- С. 55.
  6. Грибенча С.В., Н.Г.Рeвенко, И.Ф.Баринский. Влияние ежедневной иммунизации и антирабического ?-глобулина на формирование иммунных Т-киллеров у линейных мышей, зараженных уличным вирусом бешенства // Вопр. вирусол. -1988.- №5.- С.576-580.
  7. Грибенча С.В., О.В.Василенко, С.Ю.Клюшник и др. Штамм гибридных клеток животных, используемый для получения моноклональных антител к нуклеокапсидному структурному белку вируса бешенства. - Авторское свидетельство №1631073, М., 1990.
  8. Грибенча С.В. Современные аспекты биологии и профилактики лиссавирусных инфекций. - Доктор. дисс., М., 1993.
  9. Грибенча С.В., Носик Н.Н., Ершов Ф.И. Влияние индуктора интерферона двуспиральной РНК на развитие рабической инфекции // Вопр. вирусол.- 1983.- №5.- C.590-594.
  10. Катлинский А.В., Р.И.Атауллаханов, Р.Д.Холмс, А.Н.Наровлянский, М.В.Мезенцева, В.Э.Щербенко, Ф.И.Ершов Противовирусное действие препарата "Гепон" и его структурных гомологов в культуре клеток человека, инфицированных вирусом энцефаломиокардита // Иммунология.- 2003.- принято к печати.
  11. Кладова О.В., Ф.С.Харламова, А.А.Щербакова, Т.П.Легкова, Л.И.Фильдфикс, А.А.Знаменская, Г.С.Овчинникова, В.Ф.Учайкин. Первый опыт интраназального применения Гепона у детей с респираторными заболеваниями // Педиатрия.-2002.- №2.- C.86-88.
  12. Кладова О.В., Ф.С.Харламова, А.А.Щербакова, Т.П.Легкова, Л.И.Фильдфикс, В.Ф.Учайкин. Эффективное лечение синдрома крупа с помощью иммуномодулятора Гепон // Русский медицинский журнал.- 2002.- т. 10.- №3, C.138-141.
  13. Ларкин Г.Ф. - В кн.: Биометрия. М.- 1980.- C.106-107.
  14. Пшеничнов В.А., Б.Ф.Семенов, Е.Г.Зезеров. Стандартизация методов вирусологических исследований. М.- 1974.- C.123-126.
  15. Arya S.A. Therapeutic failures with rabies vaccine and RIG // Clin. Infect.Dis.- 1999.- 29.- 6.- P.1605.
  16. Dean D.S., Baer G.M. Thompson W.R. Studies of the local treatment of rabies infected wounds // Bull. WHO.- 1963.- 28.- P.477-486.
  17. Gacouin A., H.Bourhy et al. Human rabies despite postexposure vaccination // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.- 1999.- v.18.- No.3. - P. 233.
  18. Gibbons R.V., C.E.Rupprecht. Postexposure rabies prophylaxis in immunosuppressed patients // JAMA.- 2001.- 285 (12). - P.1575-1579.
  19. Gribencha S.V., L.Ya.Gribanova, G.B.Malkov, I.F.Barinsky. Population structure of some street rabies virus strains. // Arch.Virol.- 1989.- 104.- P.347-350.
  20. Habel K. Antiserum in the prophylaxis of rabies // Bull. WHO.- 1954.- 10.- P.781-788.
  21. Harmon M.N., Janis B. Studies of the interferon inducer Poly-I-Poly-C on rabies // J. Infect. Dis.- 1975.- 132.- P.241-249.
  22. >
  23. Lang J., G.N.Simanjuntak, S.Soerjasembodo et al.. Suppressant effect of human or equine rabies immunoglobulins on the immunogenicity of postexposure rabies vaccination under 2-1-1 regimen: a field trial in Indonesia // Bull. WHO.- 1998.- v.76.- No.5.- P.491-496.
  24. Lang J, Gravenstein S, Briggs D. et al. Evaluation of the safety and immunogenicity of a new, heat-treated human rabies immune globulin using a sham, post-exposure prophylaxis of rabies // Biologicals.- 1998.- 26.- P. 7-15.
  25. Pancharoen C., H. Wilde. Failure of pre- and postexposure rabies vaccination in a child infected with HIV // Scand. J. Infect. Dis.- 2001.- 33.- 5.- P.390.
  26. Wilde H., S.Sirikawin, A.Sabcharoen et al. Failure of postexposure treatment of rabies in children // Clin. Infect. Dis.- 1996.- 22.- P.228-232.
  27. Wilde H., P.Tipkong, P.Khawplod. Economic issues in postexposure rabies treatment // J. Travel. Med.- 1999.- No. 6.- P.7-11.
  28. Wilde H., P.Tipkong, V.Sitprija, N.Chaiyabutr. Heterologus antisera and antivenus are essential biological perspectives on a worldwide crisis // Ann. Intern. Med.- 1996.- v. 125.- No.3.- P. 233-236.


Версия для печати Adobe PDF
— Вопросы вирусологии, 2003, №4, c.40-44.