Версия для печати Adobe PDF
— Аллергия, астма и клиническая иммунология, 2002, №9, c.23-25.



Гепон и его структурные гомологи оказывают противовирусное действиев культуре клеток человека, инфицированных вирусом энцефаломиокардита


Катлинский А.В., Атауллаханов Р.И., Холмс Р.Д., Наровлянский А.Н., Мезенцева М.В., Щербенко В.Э., Ершов Ф.И.
ООО Иммафарма, ГНЦ-Институт иммунологии МЗ РФ, Immutic Group, НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи РАМН, Московская медицинскаяакадемия им.Сеченова



В работе изучалось влияние иммуномодулятора Гепон и его пептидных гомологов на размножение и цитопатогенное действие вируса энцефаломиокардита (ВЭМК) в культуре клеток человека in vitro. Клетки перевиваемых линий J-96 и L-41 заражали 100 ТЦД50/МЛ ВЭМК. Цитопатогенное действие вируса учитывали путем световой микроскопии через 24 часа после заражения. Противовирусную активность препаратов определяли по их способности повышать устойчивость клеток к цитопатогенному действию вируса. Клетки инкубировали в присутствии различных концентраций препаратов в течение 24 часов, затем заражали вирусом. Установлено, что Гепон обладает выраженным противовирусным действием, снижая цитопатогенное действие ВЭМК с 100% до 0. Минимальные концентрации Гепона, оказывающие противовирусное действие, составили 2,2±1,4 мкг/мл и 7,5±2,5 мкг/мл в культурах клеток J-96 и L-41, соответственно. Эффекты Гепона были сравнимы с противовирусным действием ридостина, известного индуктора интерферонов. Ридостин оказывал противовирусное действие в культурах клеток J-96 и L-41 в минимальных концентрациях 6+±2 мкг/мл и 89,9±80,1 мкг/мл, соответственно. Сравнение противовирусной активности Гепона тетрадекапептида TEKKRRETVEREKE и его структурных фрагментов, соответствующих а.к. 1-5 с N- конца (HP 1-5), а.к. 1-9 (HP 1-9), а.к. 1-11 (HP 1-11), а.к.10-14 (HP 10-14), а.к. 6-14 (НР6- 14), а.к.4-14 (НР4-14), а.к. 4-11 (НР4-11) и а.к, 3-12 (НРЗ-12), позволило исследовать связь между структурой Гепона и его противовирусным действием. Показано, что пептиды, гомологичные центральной части, а также N- и С-концам молекулы Гепона, подобны цельной молекуле Гепона по своему противовирусному действию. Как и Гепон, все исследованные пептидные гомологи эффективно защищали клетки человека от цитопатогенного действия ВЭМК. Предполагается, что оригинальный тетрадекапептид Гепон и его структурные фрагменты взаимодействуют с одним и тем же клеточным рецептором и потому обладают сходной противовирусной активностью.




Иммуномодулятор Гепон успешно применяется при лечении острых и хронических инфекционно-воспалительных процессов различной этиологии и локализации. В частности, имеются сообщения о высокой эффективности Гепона в лечении респираторных вирусных инфекций [4] и герпес-вирусной инфекции [1,2]. При применении Гепона в острой фазе герпес-вирусной инфекции отмечается быстрая регрессии герпетических поражений кожи и слизистых, а также быстрая эпителизация участков поражения.

Для понимания механизмов противовирусного действия Гепона в данной работе изучалось влияние Гепона на размножение и цитопатогенное действие вируса энцефаломиокардита (ВЭМК) в культуре клеток человека in vitro. Сравнение противовирусной активности Гепона и его структурных гомологов позволило также исследовать связь между структурой Гепона и его противовирусным действием.

Материалы и методы

Клетки

В работе были использованы перевиваемые культуры клеток J-96 (культура получена из клеток крови мужчины, больного подострой моноцитарной лейкемией [5]) и L-41 (культура перевиваемых клеток, использующаяся для титрования активности интерферонов). Клетки культивировали в среде 199, дополненной 2 mM L-глютамина, 10% инактивированной сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота, 100 Ед/мл пенициллина и анти-PPLO.

Вирус

Использовали вирус энцефаломиокардита (ВЭМК) мышей, штамм "Колумбия SK-Col-SK", в исходной концентрации 105 ТЦД50 (тканевая цитопатогенная доза, приводящая к гибели 50% клеток) в 1 мл.

Титрование ВЭМК

Предварительно за 24 часа до проведения эксперимента культуру клеток J-96 или L-4 1, выращенную и 96-луночных пластиковых панелях до монослоя, заражали ВЭМК в 10-кратиых разведениях от 10-1 до 10-8. Культуры клеток инкубировали при 37°С в атмосфере 5% С02, через 24 часа учитывали цитопатогенное действие (ЦПД) вируса с использованием инвертированного микроскопа (Leitz). При исследовании Гепона и его гомологов применяли дозу вируса 100 ТЦД50 в 1 мл.

Препараты

Гепон тетрадекапептид TEKKRJRETVEREKE и его структурные фрагменты, соответствующие а.к. 1-5 с N-конца (HP 1-5), а.к.1-9 (HP 1-9), а.к. 1-11 (НР1- 11), а.к. 10-14 (HP 10-14), а.к. 6-14 (НР6-14), а.к.4-14 (НР4-14), а.к. 4-11 (НР4-11) и а.к. 3-12 (НРЗ-12), синтезированы ООО Иммафарма. В качестве препарата сравнения применяли "Ридостин" (НПО Вектор, Новосибирск), известный индуктор интерферонов, обладающий противовирусной активностью.

Исследование противовирусного действия Гепона и его гомологов.

Клетки линии J-96 или L-41 в концентрации 200000 клеток в 1 мл высевались в 96-луночные плоскодонные культуральные планшеты в среде 199 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота, 300 мкг/мл глутамина и 100 Ед/мл пенициллина. Раствор Гепона или его пептидного гомолога вносили в культуральные планшеты склетками J-96 и L-41 в концентрации 1 мг/мл и титровали с шагом 1:2 в 24 лунках, по 3 лунки на каждую концентрацию. Эксперименты повторяли 3 раза. Противовирусный эффект оценивался по минимально эффективной концентрации (максимально эффективное разведение) препарата, защищающей 50% клеток от цитопатогенного действия 100 ТЦД50 ВЭМК в 1 мл.

Результаты и обсуждение

Противовирусное действие Гепона в культурах клеток J-96 и L-41

В контрольных культурах клеток J-96, инфицированных 100 ТЦД50/мл ВЭМК, имело место цитопатогенное действие вируса, приводящее к гибели 100% клеток. Предварительная инкубация клеток J-96 в присутствии Гепона в течение 24 часов приводила к значительному повышению их устойчивости к цитопатогенному действию ВЭМК. Во всех экспериментах Гепон подавлял развитие вирусной инфекции, снижая цитопатогенное действие ВЭМК со 100% до 0. Минимальная концентрация Гепона, оказывающая противовирусное действие в культуре клеток J-96, составила 2,2±1,4 мкг/мл. Эффекты Гепона были сравнимы с противовирусным действием ридостина, известного индуктора интерферонов. Ридостин оказывал противовирусное действие в культуре клеток J-96 в минимальной концентрации 6±2 мкг/мл (таблица 1).

Таблица 1. Противовирусное действие Гепона и его структурных гомологов в модели инфекции ВЭМК.

В культуре перевиваемых клеток L-41, как и в культуре клеток J-96, под влиянием 100 ТЦД50/мл ВЭМК имело место ЦПД, приводящее к гибели 100% клеток в течение 24 часов. Внесение Гепона в культуру клеток L-41 за 24 часа до заражения ВЭМК приводило к повышению устойчивости клеток к инфекции. В концентрации 7,5±2,5 мкг/мл Гепон защищал все клетки от цитопатогенного действия, индуцированного вирусом. Препарат сравнения - ридостин - защищал клетки L-41 от цитопатогенного действия ВЭМК в концентрации 89,9±80,1 мкг/мл (таблица 1).

Противовирусное действие гомологов центральной части молекулы Гепона

Пептиды НРЗ-12 и НР4-11 представляли центральную часть молекулы Гепона. Пептид НРЗ-12 соответствовал структуре Гепона, укороченной на 2 аминокислотных остатка с N-конца и 2 аминокислотных остатка с С-конца. Пептид НР4-11 соответствовал структуре Гепона, укороченной на 3 аминокислотных остатка с N- конца и 3 аминокислотных остатка с С-конца. Оба пептида эффективно подавляли инфекцию ВЭМК в культурах клеток J-96 и L-41 (таблица 1). Минимальная эффективная противовирусная концентрация пептида НРЗ-12 оказалась равной 3,3±0,8 мкг/мл как в культуре клеток J-96, так и в культуре клеток L-41. Пептид НР4-11 оказывал эффективное противовирусное действие в культурах клеток J-96 и L-41 в концентрациях 1,1±0,7 мкг/мл и 1,5±0,6 мкг/мл, соответственно. Из представленных данных видно, что по противовирусной активности пептиды НРЗ-12 и НР4-11 практически не отличались от Гепона. То есть укорочение молекулы Гепона на 2 или 3 аминокислотных остатка с обоих концов полипептидной цепи не нарушало его противовирусных свойств.

Противовирусная активность гомологов N-концевои части молекулы Гепона

В модели инфекции ВЭМК в культуре клеток J-96 пептиды HP 1-5, HP 1-9 и НР1-11, копирующие N-конец Гепона, обладали высокой противовирусной активностью. Минимальные эффективные концентрации этих пептидов оказались равными 0,5±0,4 мкг/мл для пептида HP 1-5, 1±0,2 мкг/мл для пептида HP 1-9 и 1,3±0,6 мкг/мл для пептида НР1-11 (таблица 1). В культуре клеток L-41, инфицированной ВЭМК, M- концевые гомологи Гепона тоже оказывали выраженное противовирусное действие. Минимальные эффективные концентрации пептидов HPI-5, HP1-9 и HP1-I1 составили 1±0,2 мкг/мл, 15±5 мкг/мл и 1,3±0,6 мкг/мл, соответственно. Следовательно, исследованные M-концсвыс пептиды не уступали гомону по противовирусной активности. Даже HPI-5, довольно короткий фрагмент N-концевой части Гепона, в полной мере проявлял противовирусную активность.

Противовирусная активность гомологов С-концевой части Гепона

В модели противовирусного действия в культурах клеток J-96 и L-41 гомологи С-концевой части молекулы Гепона HP 10-14, НР6-14 и НР4-14 эффективно защищаликлетки человека от цитопатогенного действия ВЭМК (таблица 1). В культуре клеток J-96 минимальные эффективные концентрации HP 10-14, НР6-14 и НР4-14 составили 1±0,2 мкг/мл, 2,1±0,4 мкг/мл и 2,9±1,1 мкг/мл, соответственно. В культуре клеток L-41 те жепептиды оказывали противовирусное действие при концентрациях не меньше 5 мкг/мл,2,1±1,5 мкг/мл и 10 мкг/мл, соответственно. Сравнение с эффективнымипротивовирусными концентрациями Гепона показывает, что исследованные пептиды С-концевой части молекулы Гепона не уступали полной молекуле Гепона по своей противовирусной активности.

В целом, проведенное исследование показало, что пептиды, гомологичные центральной части, а также N- и C-концам молекулы Гепона, подобны цельной молекуле Гепона по своему противовирусному действию. Как и Гепон, все исследованные пептидные гомологи эффективно защищали клетки человека in vitro от цитопатогенного действия ВЭМК. Сходные результаты были получены нами при изучении иммуномодулирующих свойств структурных гомологов Гепона [3]. В указанной работе пептидные фрагменты Гепона, копирующие центральную часть молекулы, а также ее C- и N-концы, усиливали продукцию антител к Т-зависимым антигенам, как и полная молекула Гепона. Подобие тетрадекапептида Гепона и его структурных фрагментов по биологическим эффектам - иммуноадъювантному и противовирусному - в принципе возможно. Это может происходить, если оригинальный тетрадекапептид и его фрагменты взаимодействуют с одним и тем же клеточным рецептором.



Литература

  1. Бибичева Т.В., Силина Л В Иммуномодулятор Гепон для местной терапии герпес вирусной инфекции, В к н.: Тезисы докладов IX Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 2002, с 55. 2.
  2. Бибичева Т.В., Силина Л.В. Лечение рецидивирующего генитального герпеса иммуномодулятором Гепон - В кн.: Тезисы докладов IX Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 2002, с. 56. 3.
  3. Катлинский А,В., Р.ИАтауллаханов, Р.Л.Холмс, А.В.Пичугин, Т.Б.Мастернак, Е.Ю.Малкина, Н.М.Шишкова. Иммуноадъювантное действие структурных гомологов иммуномодулятора Гепон. - Иммунология, 2002. 4.
  4. Кладова О.В., Ф.С.Харламова, А.А.Щербакова, Т.ПЛегкова, Л.И.Фильдфикс, А.А.Знаменская, Г.С.Овчинникова, В.Ф.Учайкин. Первый опыт интраназального применения Гепона у детей с респираторными заболеваниями, - Педиатрия, 2002, 2, 86-88.
  5. Osgood E.E., J.H. Brooke, Continuous tissue culture of leucocytes from human leukernic bloods by application of "gradient" principles.-Blood 1955, 10(10), 1010-1022.


Версия для печати Adobe PDF
— Аллергия, астма и клиническая иммунология, 2002, №9, c.23-25.