Версия для печати Adobe PDF
— Аллергия, астма и клиническая иммунология, 2002, №10, c.12-16.



Активация образования антител к антигенам ВИЧ при лечении больных ВИЧ-инфекцией иммуномодулятором Гепон

Холмс Р.Д.,Атауллаханов Р.И.,Катлинский А.В. ,Папуашвили М.Н.,Пичугин А.В.

ГНЦ РФ Институт иммунологии МЗ РФ, Immutic Group, ООО "Иммафарма", Московская медицинская академия им. Сеченова.



У 8 пациентов, инфицированных ВИЧ, исследовали влияние курсового лечения иммуномодулятором Гепон на интенсивность продукции антител к антигенам ВИЧ. Больные принимали Гепон по 10 мг per os один раз в день в течение 4 недель. До лечения и после его окончания в сыворотке крови исследовали содержание антител, специфически связывающихся с белками ВИЧ-1 (sgp120, gp41, p31, p24, р17) и ВИЧ-2 (sgp 105 gp36). Для этого проводили титрование исследуемых сывороток в иммуноблоте INNO-LIA HIV (Innogenetics) с последующей денситометрией и компьютерной обработкой результатов количественного иммуноблота.

У всех исследованных в крови обнаружены антитела к антигенам ВИЧ-1, но не ВИЧ-2. Установлено, что у 5 из 8 пациентов под влиянием лечения Гепоном происходило усиление продукции антител к антигенам ВИЧ-1. Чаще наблюдалось усиление выработки антител, специфичных к р31, sgp120 и р24, реже - к р17 и gp41.

Препарат Гепон (per. P№000015/04-2001) является синтетическим тетрадекапептидом [2], разрешен для применения в качестве иммуномодулятора для коррекции ослабленного иммунитета, лечения и профилактики оппортунистических инфекций (инструкция Фармакологического комитета МЗ РФ от 12.04.2001).

В предшествующем сообщении [1] было показано, что введение Гепона в организм экспериментальных животных приводит к усилению продукции lgM-антител в ходе первичной реакции на корпускулярный антиген и IgG-антител в ходе вторичной реакции на растворимый белковый антиген. В данной работе исследовано влияние Гепона на продукцию антител, специфичных к антигенам вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) у лиц, инфицированных этим вирусом.

Материалы и методы

В исследовании участвовали 8 человек (5 мужчин и 3 женщины), инфицированных ВИЧ, наблюдающихся в клинике ГНЦ Института иммунологии МЗ РФ. Участие в исследовании было добровольным. Препарат Гепон принимали внутрь по 10 мг в виде водного раствора однократно, ежедневно 1 месяца. Возраст пациентов варьировал от 27 до 44 лет (средний возраст 36 лет). Давность установления диагноза "ВИЧ-инфекция" составляла от 2 до 11 лет, в среднем 5 лет. Из анамнеза установлено, 7 из 8 пациентов были инфицированы при половых контактах с ВИЧ-инфицированным партнером. Путь инфицирования 1 пациента не был установлен.

Кровь для исследований забирали из локтевой вены утром натощак с помощью системы Vacutainer (Beckton Dickinson), сыворотку получали стандартным способом, хранили при -60°С до исследования.

Уровень антител к белкам sgp120, gp41, p31, p24, р17 (ВИЧ-1), а также gp36 и sgp105 (ВИЧ-2) оценивали с помощью наборов для иммуноблота INNO-LIA HIV Confirmation (Innogenetics, cat. К-1036) по протоколу фирмы-производителя в нашей модификации количественного определения титра антител. Сыворотки тестировали в разведении 1:100, рекомендуемом для качественного определения, а также в серии 10-кратных разведений до конечного разведения 1:10000000 для определения титра антител. Тест-полоски с нанесенными антигенами инкубировали в различных разведениях сыворотки в течение 16 ч при комнатной температуре, постоянно покачивая на автоматическом встряхивателе. После трехкратной отмывки полоски инкубировали 30 мин с конъюгатом (козьи антитела против IgG человека, конъюгированные с щелочной фосфатазой) при комнатной температуре на встряхивателе и отмывали 2 раза отмывочным буфером и 1 раз субстратным буфером. К отмытым полоскам добавляли субстрат (BCIP/NTB) и инкубировали 30 мин при комнатной температуре на встряхивателе. Реакцию останавливали 0,1М серной кислотой, инкубируя в ней полоски в течение 30 минут на встряхивателе. Чтобы избежать вариаций в интенсивности окрашивания все разведения сывороток от одного пациента исследовали в одной постановке блота.

Высушенные полоски сканировали с помощью HP ScanJet 5p, используя стандартное программное обеспечение. Количественную обработку профилей проводили с помощью пакета Scionlmadge NIH (Национальный институт здоровья, США). По графику (кривая титрования) зависимости интенсивности окрашивания от разведения сыворотки определяли разведение (титр) сыворотки, соответствующий 50% интенсивности реакции.

Результаты и обсуждение

Все пациенты обеих групп отмечали хорошую переносимость препарата. Ни в одном случае применения Гепона не было отмечено каких-либо жалоб, местных или общих побочных реакций. Все пациенты отмечали общее улучшение самочувствия в период лечения Гепоном, прибавили в весе. Среднее увеличение массы тела ко времени окончания лечения составило 2,45±0,4 кг.

На рисунке 1 представлены типичные результаты исследования методом иммуноблота сыворотки крови ВИЧ-инфицированного пациента (№1). Интенсивность (класс) ответа на каждый антиген ВИЧ определялся денситометрически путем сравнения с интенсивностью калибровочных полос 1-3 методом сканирования и анализа денситограммы с помощью программы Scionlmadge.

Рис. 1. Детекция антител к белкам ВИЧ1/ВИЧ2 методом иммуноблота INNO-L1A HIV Confirmation (Innogenetics). А - вид тест-полоски для определения антител к белкам ВИЧ. Б — денситометрическая обработка результата с помощью пакета Scionlmadge. 0,1,2,3 - калибровочные линии, для определения класса реакции: 0 - негативный контроль, 1 -уровень +/-, 2 -уровень 1+, 3 –уровень 3+.

В таблице 1 приведены результаты качественного определения содержания антител к белкам ВИЧ у 8 ВИЧ-инфицированных, принявших участие в данном исследовании. У всех пациентов наблюдался высокий уровень (класс 2-4) антител к белкам sgp120 и gp41 ВИЧ-1. Несколько ниже был уровень ответов к белкам р31, р24 и р17 ВИЧ-1. Ни у кого из исследованных не было обнаружено антител к белкам sgp105 и gp36 ВИЧ-2. Следовательно, все пациенты, принимавшие участие в исследовании, были инфицированы ВИЧ-1, но не ВИЧ-2.

Таблица 1. Классы реакции в иммуноблоте сывороток ВИЧ-инфицированных пациентов до лечения Гепоном.

Анализ кривых титрования сывороток ВИЧ-инфицированных позволил количественно охарактеризовать содержание антител к каждому конкретному антигену ВИЧ. На рисунке 2 приведен пример титрования сыворотки крови пациента (№1) в иммуноблоте. В таблице 2 приведены титры антител к белкам ВИЧ sgp120, gp41, p31, p24 и р17 у 8 исследованных пациентов до и после терапии Гепоном. По интенсивности продукции антител к различным антигенам ВИЧ исследованные пациенты значительно различались между собой до начала лечения. В частности, в крови пациента №5 уровень антител к gp41 был значительно выше, чем у других исследованных. При этом у этого же пациента регистрировались лишь небольшие количества антител к р17 и sgp120, и практически вообще не обнаруживались антитела к р31 и р24. У пациента №8 не было обнаружено антител к р17 и р31, в то время как антитела к другим антигенам ВИЧ интенсивно продуцировались. Антитела к gp41 хорошо вырабатывались у всех исследованных, хотя пациенты №4 и №6 существенно уступали другим по этому показателю. Пациент №6 уступал всем другим исследованным еще и по уровню антител к р17.

Рис. 2. Образец титрования антител к белкам ВИЧ1/ВИЧ2 с использованием набора для иммуноблота INNO-LIA HIV Confirmation (Innogenetics). Приведены данные для пациента №1 до начала лечения. По оси абсцисс - разведения сыворотки, по оси ординат - интенсивность (пиксели) окрашивания полосы соответствующего антигена. Кривые титрования антител к: 1 — sgp120, 2 - gp41, 3 - р31, 4 - р24, 5 - р17. Сечение (6) по уровню 50% от максимальной интенсивности использовано для определения титров.

Таблица 2. Титры и относительные изменения содержания антител к различным белкам ВИЧ в крови исследованных пациентов до и после лечения Гепоном. Примечания: А — до лечения, В - после лечения Гепоном. Представлены значения титров антител, специфичных в отношении указанного белка ВИЧ (соответственно, колонки обозначены sgp120, gp41, р31, р24, р17). Коэффициент усиления продукции антител, специфичных к данному белку ВИЧ, указан в виде К с соответствующим значком антигена.

Приведенные данные свидетельствуют об иммуномодулирующем влиянии Гепона у пациентов, инфицированных ВИЧ. Это хорошо согласуется с описанным ранее [1] усилением продукции антител у экспериментальных животных, иммунизированных чужеродным антигеном в сочетании с оральным или парентеральным введением Гепона. В случае лечения Гепоном ВИЧ-инфицированных пациентов получен аналогичный эффект усиления продукции антител. Иммунизирующими антигенами у таких пациентов являются белки ВИЧ.

Из представленных результатов очевидны различия между исследованными пациентами по усилению продукции антител к различным белкам ВИЧ. Они могут проистекать из различий между исследованными лицами как по HLA-фенотипу, так и по вирусной нагрузке. Хорошо известно, что интенсивность синтеза антител к каждому конкретному вирусному антигену зависит от количества антигена (вирусная нагрузка) и от индивидуальных особенностей (HLA-фенотип), определяющих способность данного человека реагировать на данный антиген.

В целом, невзирая на индивидуальные различия между пациентами, факт усиления продукции антител к антигенам ВИЧ у лиц, инфицированных ВИЧ, свидетельствует об усилении противовирусной защиты в результате лечения иммуномодулятором Гепон.

Список литературы

  1. Атауллаханов Р.И., А.В.Катлинский, Р.Д.Холмс, Т Б.Мастернак, А.С.Ларин, Е.Ю.Малкина, Н.М.Шишкова. Усиление образования антител под влиянием иммуномодулятора Гепон // Иммунология. - 2002.
  2. US Patent 5773573 dated 30.06.1998.

Примечание: работа спонсировалась Immutic Group.



Версия для печати Adobe PDF
— Аллергия, астма и клиническая иммунология, 2002, №10, c.12-16.